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微生物菌株传代与保存试验

发布:2021-06-22 阅读:936

.目的

对实验室的标准菌株进行合理操作确保菌株的长久使用和性能稳定

.传代实验

1.将在室温放置30分钟的菌种斜面管移入超净工作台中。

2.点燃酒精灯,先用左手将菌种管的试管口斜向上靠近火焰,缓慢旋转加热灭菌。用右手在火焰旁轻轻转动橡胶塞,以便易拔取,再用右手持接种环在火焰上烧红30秒,随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧,往返通过3次。

3.在火焰旁,用右手的无名指、小指及手掌部夹住橡胶塞,轻轻拔出橡胶塞,并勿使其与任何物品接触。将灼烧过的接种环伸入菌种管内,先接触无菌生长的培养基,待冷后,从斜面上挑取少量菌苔,取出时,接种环放置在火焰旁。左手的菌种管口旋转地在火焰上受热灭菌,右手无名指、小指及手掌部夹住的橡胶塞快速地来回通过火焰,并迅速塞回菌种管上。再将菌种管的管口处在火焰上灭菌。

4.同样的操作,将接种管的橡胶塞拔出,把粘有菌种的接种环轻贴斜面的表面,由下到上曲折移动,使菌种划在斜面的表面上,注意只划动一次,勿重复移动,且勿使菌苔沾在管壁口。再用同样的操作将橡胶塞塞回接种管,然后将接种管的管口处在火焰上灭菌。接种过的接种环在火焰上灼烧灭菌。

已接种完毕的各管贴好标签,注明菌名、编号、代次(n+1)和传代日期、操作人、有效期,同时填好《菌种使用记录表》。

5.按规定的温度和时间培养。

6.培养到期后取出培养物,仔细观察菌苔形状,是否正常,并与上代菌种比较,有无杂菌。必要时涂片,革兰氏染色镜检。

检查合格的菌种,放入冰箱内2-8℃保存,一般一个月转钟一次。一般情况:当工作菌株小于5代时可直接用上一代工作用菌种接种下一代工作用菌种,作为工作用菌种。也可选用保存的菌种进行复苏,直接作为工作用菌种。细菌每1个月传代一次,酵母菌每2个月传代一次,霉菌及芽孢每3个月传代一次。当超过5代,需用传代用菌种传代。传代时应无菌操作,使菌株不死亡、不污染、不丢失。实验人员应采取有效的预防措施进行自我保护,穿好工作服,佩戴无菌手套,实验完成后对实验区域、实验仪器和器具进行消毒。

菌株编号:传代用菌种可用字母“G”表示,工作用菌种可用字母“W”表示。菌种的英文缩写:大肠埃希氏菌(E.c),金黄色葡萄球菌(S.a),白色念珠菌(C.a)等等。传代日期用6位数字表示,年份取最后两位数,如2021年06月21日传代的第一支大肠埃希氏菌作为传代用菌种的编号为:E.c-G3-210624-01。

.保存方法

1.斜面低温保藏法

1.1操作方法

无菌条件下,将待保存的菌株菌落或悬浊液,以无菌操作接种在适宜的固体斜面培养基上,按规定的温度和时间培养,待充分生长后,把培养好的新鲜的菌种的橡胶塞部分用牛皮纸包扎好,移至2-8℃的冰箱中低温保藏,保藏时间依微生物的种类不同而确定。定期对保存的菌株进行转种,转种频率为一月一次。

1.2 注意事项

①必须定期检查保藏菌种冰箱温度和菌种管的橡胶塞是否松动或生霉,如有异常应及时处理。

②每次移植后,应与原菌种的编号、名称逐一核对,确保培养基特征和纯度无误后在继续保藏。

2.瓷珠菌种保管法

2.1 操作方法

在无菌条件下,用浸过75%酒精的脱脂棉擦净冻存管表面并让其自然风干,打开冻存管的螺旋瓶盖,用灭菌的接种环挑取待保存的菌株菌落或悬浊液,放入冻存液中;拧紧瓶盖,来回颠倒使菌体乳化为混浊的菌悬浊液,此时菌悬浊液会吸附在小瓷珠内外表面;用无菌移液器将冻存管中的菌悬浊液尽量吸出(吸出的菌悬浊液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理);拧紧瓶盖贴上相应的详细标签,并做好相关菌种记录,将冻存管置于-20℃冰箱中密封上锁保存。

3.液体石蜡保藏法

3.1 操作方法

将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上具砂芯的硅胶塞,并用牛皮纸包扎,121℃灭菌30min,然后放在40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用。将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中,在适宜条件下培养结束后,用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种管内,并使石蜡高出菌种表面约1cm,使菌体与空气隔绝,并将试管直立,置于-20℃冷冻或冷藏保存。

4.甘油冷冻保藏法

4.1 操作方法

刮取平板或琼脂斜面的培养物,放入装有无菌纯化水的试管中,通过接种环与试管壁间的摩擦,使细菌充分扩散到纯化水中,制备成菌悬液。向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度20%(V/V)),即为10%(V/V)甘油菌悬液,轻轻振摇,充分混合后,分装于无菌小试管或冻存管,冷冻保存。-20℃保存,一般菌株可保存3年以上,链球菌、奈瑟菌可保存12-15个月。

(检验分析中心)



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