一.目的

对实验室的标准菌株进行合理的操作，确保菌株的长久使用和性能的稳定。

二.传代实验

1.将在室温放置30分钟的菌种斜面管移入超净工作台中。

2.点燃酒精灯，先用左手将菌种管的试管口斜向上靠近火焰，缓慢旋转加热灭菌。用右手在火焰旁轻轻转动橡胶塞，以便易拔取，再用右手持接种环在火焰上烧红30秒，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。

3.在火焰旁，用右手的无名指、小指及手掌部夹住橡胶塞，轻轻拔出橡胶塞，并勿使其与任何物品接触。将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先接触无菌生长的培养基，待冷后，从斜面上挑取少量菌苔，取出时，接种环放置在火焰旁。左手的菌种管口旋转地在火焰上受热灭菌，右手无名指、小指及手掌部夹住的橡胶塞快速地来回通过火焰，并迅速塞回菌种管上。再将菌种管的管口处在火焰上灭菌。

4.同样的操作，将接种管的橡胶塞拔出，把粘有菌种的接种环轻贴斜面的表面，由下到上曲折移动，使菌种划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。再用同样的操作将橡胶塞塞回接种管，然后将接种管的管口处在火焰上灭菌。接种过的接种环在火焰上灼烧灭菌。

已接种完毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和传代日期、操作人、有效期，同时填好《菌种使用记录表》。

5.按规定的温度和时间培养。

6.培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形状，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。必要时涂片，革兰氏染色镜检。

检查合格的菌种，放入冰箱内2-8℃保存，一般一个月转钟一次。一般情况：当工作菌株小于5代时可直接用上一代工作用菌种接种下一代工作用菌种，作为工作用菌种。也可选用保存的菌种进行复苏，直接作为工作用菌种。细菌每1个月传代一次，酵母菌每2个月传代一次，霉菌及芽孢每3个月传代一次。当超过5代，需用传代用菌种传代。传代时应无菌操作，使菌株不死亡、不污染、不丢失。实验人员应采取有效的预防措施进行自我保护，穿好工作服，佩戴无菌手套，实验完成后对实验区域、实验仪器和器具进行消毒。

菌株编号：传代用菌种可用字母“G”表示，工作用菌种可用字母“W”表示。菌种的英文缩写：大肠埃希氏菌（E.c），金黄色葡萄球菌（S.a），白色念珠菌（C.a）等等。传代日期用6位数字表示，年份取最后两位数，如2021年06月21日传代的第一支大肠埃希氏菌作为传代用菌种的编号为:E.c-G3-210624-01。

三.保存方法

1.斜面低温保藏法

1.1操作方法

无菌条件下，将待保存的菌株菌落或悬浊液，以无菌操作接种在适宜的固体斜面培养基上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜的菌种的橡胶塞部分用牛皮纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中低温保藏，保藏时间依微生物的种类不同而确定。定期对保存的菌株进行转种，转种频率为一月一次。

1.2 注意事项

①必须定期检查保藏菌种冰箱温度和菌种管的橡胶塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。

②每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确保培养基特征和纯度无误后在继续保藏。

2.瓷珠菌种保管法

2.1 操作方法

在无菌条件下，用浸过75%酒精的脱脂棉擦净冻存管表面并让其自然风干，打开冻存管的螺旋瓶盖，用灭菌的接种环挑取待保存的菌株菌落或悬浊液，放入冻存液中；拧紧瓶盖，来回颠倒使菌体乳化为混浊的菌悬浊液，此时菌悬浊液会吸附在小瓷珠内外表面；用无菌移液器将冻存管中的菌悬浊液尽量吸出（吸出的菌悬浊液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理）；拧紧瓶盖贴上相应的详细标签，并做好相关菌种记录，将冻存管置于-20℃冰箱中密封上锁保存。

3.液体石蜡保藏法

3.1 操作方法

将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上具砂芯的硅胶塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm，使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或冷藏保存。

4.甘油冷冻保藏法

4.1 操作方法

刮取平板或琼脂斜面的培养物，放入装有无菌纯化水的试管中，通过接种环与试管壁间的摩擦，使细菌充分扩散到纯化水中，制备成菌悬液。向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%（V/V）），即为10%（V/V）甘油菌悬液，轻轻振摇，充分混合后，分装于无菌小试管或冻存管，冷冻保存。-20℃保存，一般菌株可保存3年以上，链球菌、奈瑟菌可保存12-15个月。

（检验分析中心）