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液相色谱分析法

发布:2021-07-27 阅读:1847

液相色谱分析法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同,液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式,液相色谱法可以分为柱色谱法纸色谱法薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱离子交换色谱凝胶渗透色谱。近年来,在液相柱色谱系统中加上高压液流系统,使流动相在高压下快速流动,以提高分离效果,因此出现了高效(又称高压)液相色谱法。

一、液相色谱分析法分类

高效液相色谱法按组分在固定相和流动相两者间分离机理不同可分为:液固吸附色谱、化学键合相色谱、液液分配色谱、离子交换色谱法、凝胶色谱法。

1.液固吸附色谱

   液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相,吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质,如硅胶、氧化铝分子筛、聚酰胺等,在它们的表面存在吸附中心,各组分在两相中作相对运动,利用各组分在两相中吸附作用的不同来进行分离。色谱的分离过程是在吸附剂表面进行的,不进入固定相的内部。与气相色谱不同,流动相(即溶剂)分子也与吸附剂表面发生吸附作用。在吸附剂表面,样品分子与流动相分子进行吸附竞争,因此流动相的选择对分离效果有很大的影响,一般可采用梯度淋洗法来提高色谱分离效率。在聚合物的分析中,吸附色谱一般用来分离添加剂,如偶氮染料抗氧化剂、表面活性剂等,也可用于石油烃类的组成分析。

2.化学键合相色谱法

化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体(硅胶)表面,形成均一、牢固的单分子薄层而构成固定相。兼有吸附和分配两种分离机理,对多数键合相来说,以分配机理为主。通常化学键合相的载体是硅胶,硅胶表面有硅醇基( ≡Si–OH),它能与合适的有机化合物反应,获得各种不同性能的化学键合相。如:酯化键合(≡Si-O-C)、硅氮键合(≡ Si-N)和硅烷化键合(≡Si-O-Si-C)等;硅烷化键合相应用最广泛。十八烷基硅烷键合相(Octadecylsilane 简称ODS或C18)是最常用的非极性键合相。它们用于反相色谱法,可在70℃以下和pH 2~8范围内可正常工作。

化学键合固定相具有如下优点:柱效高--传质速度比一般液体固定相快;稳定性--耐溶剂冲洗,耐高温,无固定液流失,从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命;应用范围广--改变键合有机分子的结构和基团的类型,能灵活地改变分离的选择性,适用于分离几乎所有类型的化合物;且能用各种溶剂作流动相(包括梯度洗脱)。

3.液液分配色谱法

流动相与固定相(在惰性载体表面涂敷或键合一层固定液薄膜,涂层固定相或键合固定相,键合固定相使用更多)为互不相溶的两种液体,组分既溶解于固定相,也溶解于流动相,被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异,通过溶质在两相之间进行分配以实现分离,相当于液--液萃取。一般常用的固定液有β,β'-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEG400~4000)、三甲撑乙二醇(TMG)和角鲨烷(SQ)等。采用与气相色谱(GC)同样的方法,将固定液涂渍在多孔的载体表面,但在使用中固定液易流失。目前,应用较多的是键合固定相。在这种固体相中,固定液不是涂在载体表面,而是通过化学反应在纯硅胶颗粒表面键合上某种有机基团。例如,利用氯代十八烷基硅烷与硅胶表面的羟基(-OH)之间的反应就可以形成一烷基化表面。这种固定液的优点是不易被流动相剥蚀。在分配色谱法中,流动相可为纯溶剂,也可以采用混合溶剂进行梯度淋洗,其极性应与固定液差别大一些,以避免两者之间相溶。

根据固定相与流动相的极性不同,分为正相色谱反相色谱。正相色谱是用硅胶或极性键合相为固定相,非极性溶剂为流动相;反相色谱是硅胶为基质的烷基键合相为固定相,极性溶剂为流动相,适用于非极性化合物的分离。

4.离子交换色谱法

离子交换色谱通常以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相,利用被分离组分离子(样品离子)与固定相离子进行可逆交换,其交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离的色谱方法称为离子交换色谱法。按照可交换离子所带电荷符号的不同又可分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。薄壳型离子交换树脂柱效高,主要用来分离简单的混合物;多孔性树脂进样容量大,主要用来分离复杂混合物。

离子交换树脂缺点是易于膨胀,传质较慢,柱效低,不耐高压。HPLC中的固定相是键合在薄壳型和多孔微粒硅胶上的离子交换剂,其机械强度高,不溶胀,耐高压,传质快,柱效高。

离子交换色谱法的流动相是具有一定pH值和离子强度的缓冲溶剂,或含有少量有机溶剂,如甲醇、乙醇、四氢呋喃、乙腈等,以提高色谱选择性。

离子交换色谱法的保留行为和选择性(吸附性)与被分离的离子、离子交换剂以及流动相的性质等有关。离子交换剂对不同离子的交换选择性不同,一般来说,离子的价数越高,原子序数越大,水和离子半径越小,则该离子在离子交换剂上的选择性系数就越大。

强酸型阳离子交换树脂对阳离子的选择性系数顺序为:Fe3+〉Al2+〉Ba2+〉Pb2+〉Sr2+〉Ca2+〉Ni2+〉Cd2+〉Cu2+〉Co2+〉Mg2+〉Zn2+〉Mn2+〉Ag+〉Cs〉Rb+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+

弱酸型阳离子交换树脂的基团(如一COOH)的离解受溶液中H+抑制,所以H+在该类树脂上的保留能力很强,甚至大于二价、三价阳离子。

强碱型阴离子交换树脂对阴离子的选择性系数顺序为:柠檬酸根〉PO43-〉SO42-〉I-〉NO3-〉SCN-〉NO2-〉Cl-〉HCO3-〉CH3COO-〉OH-〉F-

离子的保留还受流动相的组成和pH值的影响:交换能力强、选择性系数大的离子组成的流动相具有强的洗脱能力。流动相的离子强度增大,其洗脱能力增强,使组分的保留值降低。强离子交换树脂的交换容量在很宽的范同内不随流动相的pH值变化。pH值的调节主要体现其对弱电解质离解的控制,溶质的离解受到抑制,其保留时间变短。因此,pH值的变化,对弱离子交换树脂的交换能力影响较大。

离子交换色谱法是新发展起来的一项现代分析技术,已广泛用于氨基酸、核酸、蛋白质的分析,也适合于某些无机离子(NO3-、SO42-、Cl-等无机阴离子和Na+、Ca2+、Mg2+、K+等无机阳离子)的分离和分析,具有十分重要的作用。

4.凝胶渗透色谱法

凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。又称为尺寸排阻色谱法。1959年首先用于生物化学领域。以溶剂为流动相,多孔填料(如多孔硅胶、多孔玻璃)或多孔交联高分子凝胶为固定相(软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶)的液相色谱法。混合物溶液进入凝胶色谱柱,流经多孔凝胶时,体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过,较早地被冲洗出柱外,而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去,较晚地被冲洗出来,混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。

凝胶渗透色谱的优点:分离不需要梯度冲洗装置;同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量;试样在柱中稀释少,因而容易检测;组分的保留时间可提供分子尺寸信息;色谱柱寿命长。它的缺点是:不能分离、分辨分子大小相近的化合物,分子量相差需在10%以上时才能得到分离。分子尺寸相同的混合物,色谱柱的分离度低;峰容量小;凝胶渗透色谱法适宜于分离相对分子质量大的化合物,相对分子质量在400~8×105的任何类型的化合物,此外还可用来分离低聚物、单体和聚合物添加剂等。

目前,凝胶色谱法既适用于水溶液的体系,又适用于有机溶剂的体系。当所用的洗脱剂为水溶液时,称为凝胶过滤色谱,其在生物界的应用比较多;采用有机溶剂为洗脱剂时,称为凝胶渗透色谱,在高分子领域应用较多。

5.离子色谱法

根据不同的分离方式,离子色谱可以分为高效离子色谱 、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂分离机理主要是离子交换离子排斥色谱法用高容量的树脂,分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂,分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。

离子色谱仪由淋洗液贮存器 、泵 、进样阀 、分离柱 、抑制柱、电导检测器和数据处理单元等组成。离子色谱仪最重要的部件是分离柱,装有离子交换树脂。抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件,其作用是将淋洗液转变成低电导部分,以降低来自淋洗液的背景电导,同时将样品离子转变成其相应的酸或碱,以增加其电导。

分离阴离子,抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂;分离阳离子,抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂检测器分通用型检测器与专用型检测器。前者如电导检测器,对检测池中所有离子都有响应;后者如紫外-可见分光光度计,对离子具有选择性响应。

6.离子对色谱法

离子对色谱法是将一种(或数种)与样品离子电荷(A+)相反的离子(B-,称为对离子或反离子)加入到色谱系统的流动相(或固定相)中,使其与样品离子结合生成弱极性的离子对(呈中性缔合物)。该离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中,从而控制溶质离子的保留行为。

离子对色谱法(特别是反相)解决了以往难以分离的混合物的分离问题,诸如有机酸、碱及离子、非离子混合物,如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

二、液相色谱的固定相和流动相的选择

液相色谱固定相主要有液固吸附色谱固定相、液液分配色谱固定相、离子交换色谱键合固定相和凝胶色谱固定相等类型。
1.液相色谱固定相的分类及组成

1.1液固吸附色谱 

1.1.1硅胶:为刚性固体。表面多孔硅胶:在30~40μm的玻璃微球表面附着一层厚度为1~2μm的多孔硅胶而成。易装柱,柱效不高,柱容量小。全多孔硅胶。无定形全多孔硅胶:柱效高,柱容量大,价廉。但要匀浆装柱。球形全多孔硅胶:柱效高,柱容量大,涡流扩散小,渗透性好,价廉。全多孔微粒硅胶:传质阻抗小,柱容量大。
1.1.2分子筛:为强极性。
1.1.3高分子多孔微球:非极性高分子多孔微球:由苯乙烯和二乙烯苯交联而成。柱选择性好,峰形好,柱效低。适合分离弱极性化合物。极性高分子多孔微球:在苯乙烯和二乙烯苯交联而成的聚合物中引入极性官能团而成。
1.1.4氧化铝:为弱极性。

1.1.5活性炭:为非极性。

1.2液液分配色谱:固定相由载体和固定液组成。

1.2.1涂渍固定液:载体有硅胶、氧化铝和硅藻土等。硅胶有表面多孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶和全多孔微粒硅胶。目前械涂渍固定液已逐渐被键合固定相取代。
1.2.2键合固定相:载体有200~300m2/g的硅胶和聚合物(如聚苯乙烯和聚乙烯醇胶等)。目前载体几乎都是硅胶,有表面多孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶和全多孔微粒硅胶。
1.2.2.1非极性键合固定相:键合非极性基团,常用十八烷基硅烷键合固定相(ODS)。用于反相色谱。
1.2.2.2弱极性键合固定相:常用醚基和二羟基等键合固定相。用于反相或正相色谱。
1.2.2.3极性键合固定相:键合极性基团,常用氨基和氰基等键合固定相。用于正相色谱。

1.3离子交换色谱:将离子交换基团键合到硅胶基质表面上形成的键合固定相。载体有硅胶、合成树脂和纤维素等,多为全多孔微粒硅胶。离子交换基团有-SO3H(强酸型)和-NR3Cl(强碱型)等。

1.4凝胶色谱:凝胶是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体,含有大量液体(一般为水),柔软而富于弹性。有软性凝胶、半刚性凝胶和刚性凝胶。

2. 流动相分类

按组成:单组分、多组分;按极性:极性、弱极性、非极性;按使用方式:固定组成洗脱、梯度洗脱。常用溶剂:甲醇、乙醇、乙腈、水、己烷、四氯化碳、乙酸乙酯等。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性,可以改进分离或调整出峰时间。常见溶剂的极性顺序:水>乙腈>甲醇>乙醇>四氢呋喃>乙酸乙酯>四氯化碳>环己烷。常用流动相:甲醇+水,乙腈+水,乙酸铵溶液,磷酸及磷酸盐溶液等。

3.流动相的选择

选择高纯度试剂,如色谱纯试剂,使用前经滤膜过滤。防止微量杂质进入色谱柱和仪器系统;配制的流动相溶液要进行过滤。储存流动相的容器有透明玻璃棕色瓶,需要避光的流动相首选棕色瓶盛装。

(1) 流动相能溶解试样,但不能与样品发生反应;

(2)与固定相不互溶,也不发生不可逆反应,不能发生作用使柱效下降或损坏色谱柱;

(3)粘度要尽可能小,这样才能有较高的渗透性和柱效;

(4)应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时,流动相不应有紫外吸收;

(5)容易精制、纯化、毒性小,不易着火、价格尽量便宜等;

(6)要求流动相对固定相的溶解度尽可能小;

(7)固定液是极性物质时,选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂,称为正相分配色谱,适合于分离极性化合物;

(8)选用非极性物质为固定相,而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱,这种色谱适合分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。

三、液相色谱和气相色谱方法比较

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紫外吸收检测器(UVD)、二极管阵列检测器(PDAD)、荧光检测器(FLD)、电化学检测器(ED或ECD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、示差折光检测器(RID)、质谱检测(MSD)                                                                                                                                               四、液相色谱分析法的应用

可以分离分析分子量大的、热不稳定的、不具挥发性的、可以离解或不离解的各种分子量的物质。如NO3-、SO42-、Cl-等无机阴离子和Na+、Ca2+、Mg2+、K+等无机阳离子,染料、抗氧化剂、防腐剂、苯酚等。这些物质可以是离子态的、分子态的、同分异构体(如2,4-二氨基甲苯和2,6-二氨基甲苯)或具有生化活性的物质,如DNA(由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物,由碱基脱氧核糖磷酸构成。碱基4种:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C))。

液相色谱仪广泛应用于药物研制和生产、环境检测、生物化学、卫生检验、食品安全、国土安全、石油化工、科学研究等领域。能对有机化合物中百分之七十到百分之八十的化合物进行分离与分析。

生活饮用水标准检验方法(有机物指标GB/T 5750.8-2006、农药指标GB/T 5750.9-2006)共有7个指标可用液相色谱法进行测定,采用紫外检测器可以分析微囊藻毒素、甲萘威、溴氰菊酯、莠去津,采用荧光检测器可以分析苯并(a)芘、呋喃丹和甲萘威、草甘磷。其中荧光检测器和紫外检测器均可测定甲萘威。

工作场所空气有毒物质测定( GBZ/T160、GBZ/T300指标对应方法),采用紫外检测器可以分析苦味酸(三硝基苯酚)、β-萘酚、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯、考的松、18-甲基炔诺酮(炔诺孕酮)、五氯酚及其钠盐、三氯乙醛、氢醌、对甲苯磺酸、马来酸酐、硫酸二甲酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、异佛尔酮二异氰酸酯、硝基胍、黑索金(环三次甲基三硝胺)、苯醌、甲苯二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯,采用荧光检测器可以分析蒽、菲、3,4苯并芘。使用十八烷基硅烷键合相色谱柱(Octadecylsilane 简称ODS或C18),250mm×4.6mm×5µm,可以完成工作场所空气中上述有毒物质的分离分析。


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